Tests RT-PCR

RT-PCR : une technique d’identification redoutable
Historiquement, la première technique mise au point pour identifier un agent biologique était la PCR, Polymerase Chain Reaction (ou réaction en chaîne par polymérase). Utilisant l’ADN de l’agent biologique, cette technique de biologie moléculaire permet de dupliquer en grand nombre, avec un facteur de multiplication de l’ordre du milliard, une séquence d’ADN connue, à partir d’une très faible quantité d’échantillon de l’agent biologique recherché.

Mais le SARS-CoV-2, virus responsable de la maladie Covid-19, appartient à la famille des ribovirus. Il ne contient pas d’ADN mais contient de l’ARN*. La technique de PCR ne permet donc pas d’accéder directement à sa carte d’identité génétique faite d’ARN. Une étape préalable s’impose : commencer par transformer l’ARN de SARS-CoV-2 en ADN correspondant.

Cette étape supplémentaire utilise une variante de la technique de PCR : la RT-PCR, Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (ou réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse). Cette transcription inverse est en fait le mécanisme par lequel l’ARN va d’abord être transformé en ADN correspondant. Cette transformation est assurée par une enzyme, la transcriptase inverse qui rétrotranscrit (RT-PCR) l’ARN et synthétise l’ADN correspondant. La suite du processus du test consiste à multiplier le fragment d’ADN synthétisé pour obtenir un grand nombre de copies identiques de ce fragment afin d’en disposer en quantité suffisante pour pouvoir l’identifier formellement. Cette multiplication est possible grâce à une autre enzyme, de la famille des polymérases. Cette étape correspond à la réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR).
Ce processus terminé, il est maintenant possible de détecter la présence du virus et de mesurer la charge virale à partir d’un prélèvement contenant une très faible quantité de virus, quelques millièmes de milliardièmes de gramme suffisent.

[…] Qu’est-ce qu’un test RT-PCR ?
[...]
Le CNR a développé deux tests RT-PCR, respectivement IP2 et IP4, dans le cadre de l’épidémie de Covid-19. Ces deux tests utilisent chacun trois séquences distinctes du génome du SARS-CoV-2. Il s’agit de deux séquences « amorces » qui permettent l’amplification d’une courte séquence du génome du virus et d’une séquence « sonde » qui permet la détection en venant se fixer sur les séquences amplifiées à l’aide des deux amorces. Il faut donc une correspondance du matériel génétique dans le prélèvement avec les trois séquences simultanément pour obtenir un résultat positif. Si l’une de ces trois séquences ne se fixe pas, aucun signal n’est détecté, le résultat est négatif. […]

Fiabilité du test RT-PCR
Pour garantir la performance du test lors de son développement, un système a permis de détecter si les trois séquences utilisées pour la reconnaissance du SARS-CoV-2 étaient  présentes dans d’autres organismes vivants.
En ce qui concerne les tests RT-PCR développés par le CNR, les trois séquences ne sont pas présentes de manière simultanée chez un autre organisme que le SARS-CoV-2.
Ensuite, le test est validé sur des échantillons primaires (contrôles positifs et négatifs) pour vérifier la spécificité et la sensibilité du test (pas de faux positifs ou de faux négatifs). Les contrôles négatifs (ici par exemple des prélèvements nasaux ou de gorge antérieurs à 2019) permettent d’évaluer le risque d'amplification non spécifique.
Enfin, il est recommandé d’utiliser deux tests différents (au CNR de l’Institut Pasteur, ils sont respectivement nommés IP2 et IP4) sur un même échantillon afin de garantir la fiabilité du résultat. Il n’y aura donc plus seulement trois séquences du génome du virus à reconnaître et amplifier mais six séquences. Cela fournit une fiabilité supplémentaire aux tests RT-PCR.

Dans un avis du 10 février 2021, la Haute autorité de Santé a autorisé les tests RT-PCR sur prélèvement salivaire de détection du Covid-19 dans les indications suivantes :

•  Pour les personnes asymptomatiques, dans le cadre d’un dépistage itératif ciblé à large échelle sur population fermée. Par exemple, cela peut concerner, d’une part, les établissements d’accueil du jeune enfant et les élèves des écoles et collèges, et d’autre part, les établissements de santé, les établissements sociaux et médico-sociaux (pour enfants et adultes en situation de handicap, pour personnes âgées), à la fois pour le personnel et pour les patients ou résidents.

•  Pour les personnes-contacts et les personnes symptomatiques, lorsque le prélèvement nasopharyngé est difficile ou impossible.

Le caractère non invasif du prélèvement permet une très bonne acceptabilité des tests salivaires, notamment lors de campagnes de dépistage itératives (répétées) chez les personnes asymptomatiques. Ces tests sont pour ces raisons utilisés dans le cadre des campagnes de dépistages organisées par l’Éducation nationale au sein des écoles primaires et des maternelles.

Consultez notre guide d’accompagnement pour réaliser un test salivaire, et sa version imprimable.

À noter qu’à ce jour, seuls les tests RT-PCR sont autorisés sur prélèvement salivaire. Les autotests et les tests antigéniques sur prélèvement salivaire ne sont pas autorisés en France par la HAS en raison de leurs performances jugées insuffisantes.

La Haute Autorité de santé a confirmé la bonne sensibilité des tests RT-PCR salivaires. La sensibilité de ces tests est estimée à 85%, ce qui est légèrement inférieur (3% à 11%) à celle des tests RT-PCR qui utilisent le prélèvement nasopharyngé.
Ce niveau de performance permet de les reconnaitre et de les déployer en France, notamment au sein des écoles.

Cependant, en raison notamment d'une sensibilité de ces tests légèrement inférieure (3 % à 11 %) à celle des tests RT-PCR sur prélèvement naso-pharyngé (néanmoins supérieure aux seuils fixés), la HAS précise dans son avis les conditions techniques de réalisation de ces tests et les critères de performance à satisfaire.

• Le prélèvement salivaire peut être réalisé de manière assistée ou en auto-prélèvement au laboratoire de biologie médicale, au domicile ou sur un site de dépistage. S'il est difficile pour le patient de cracher (par exemple pour les très jeunes enfants), la salive peut être prélevée sous la langue à l'aide d'une pipette.

• Le prélèvement doit être réalisé 30 minutes après la dernière prise de boisson, d'aliment, de cigarette (ou e-cigarette), d'un brossage des dents ou d'un rinçage bucco-dentaire. Et l'échantillon recueilli doit être conservé dans un flacon sec et stérile à température ambiante.

• En cas d'auto-prélèvement, le patient doit avoir reçu une information claire sur les conditions de sa réalisation et un matériel adapté.

• L'échantillon de salive recueilli doit être analysé dans les 24 heures.

• En raison de la grande hétérogénéité entre les kits utilisés pour les différents tests RT-PCR salivaires, la HAS recommande que ne soient utilisés que ceux qui comportent au moins deux cibles moléculaires et ayant une sensibilité minimale de 80 % sur le prélèvement salivaire.